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人膜攻擊復(fù)合物（MAC）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用

目的：本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關(guān)

液體樣本中膜攻擊復(fù)合物（MAC）的含量。

實驗原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人膜攻擊復(fù)合物（ MAC）水平。用純化的人

膜攻擊復(fù)合物（MAC）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入膜

攻擊復(fù)合物（MAC），再與 HRP標記的羊抗人抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，

經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在  HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下

轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的膜攻擊復(fù)合物（ MAC）呈正相關(guān)。用酶標儀在

450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人膜攻擊復(fù)合物（MAC）含

量。

試劑盒組成：

試劑盒組成

說明書

48孔配置

1份

96孔配置

1份

保存

封板膜

2片（48）

1個

2片（96）

1個

密封袋

酶標包被板

標準品：135pg/mL

標準品稀釋液

酶標試劑

1×48

1×96

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

0.5ml×1瓶

1.5ml×1瓶

3 ml×1瓶

3 ml×1瓶

3 ml×1瓶

3 ml×1瓶

3ml×1瓶

（20ml×20倍）×1瓶

0.5ml×1瓶

1.5ml×1瓶

6 ml×1瓶

6 ml×1瓶

6 ml×1瓶

6 ml×1瓶

6ml×1瓶

（20ml×30倍）×1瓶

樣品稀釋液

顯色劑 A液

顯色劑 B液

終止液

濃縮洗滌液

樣本處理及要求：

1.血清：室溫血液自然凝固  10-20分鐘，離心  20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上

清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2.血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇   EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合  10-20分鐘后，離心

20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次

離心。

3.尿液：用無菌管收集，離心   20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程

中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

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4.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心  20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/

分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞

濃度達到 100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心  20分

鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的  PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?/span>

用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的  PBS（PH7.4），用手工或勻漿器

將標本勻漿充分。離心 20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待

檢測，其余冷凍備用。

6.標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上

進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7.不能檢測含NaN3的樣品，因    NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.

標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔 10孔，在*、第二孔中分別加標

準品 100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液 50μl，混勻；然后從*孔、第二

孔中各取 100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液 50μl，

混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl棄掉，再各取  50μl分別加到第五、第六孔

中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各

取 50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液  50μl，混

勻后從第七、第八孔中分別取 50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準

品稀釋液 50μl，混勻后從第九第十孔中各取 50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl，

濃度分別為 90 pg/mL，60 pg/mL，30  pg/mL，15 pg/mL，7.5 pg/mL）。

加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣

品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣

品zui終稀釋度為 5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混

勻。

2.

3.

4.

5.

溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育30分鐘。

配液：將 30（48T的  20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T的  20倍）倍稀釋后備用。

洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30秒后棄去，如此

重復(fù) 5次，拍干。

6.

7.

8.

9.

加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。

溫育：操作同 3。

洗滌：操作同 5。

顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

15分鐘.

10.終止：每孔加終止液   50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應(yīng)在加終止

液后 15分鐘以內(nèi)進行。

注意事項：

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡  15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未

用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間

控制在 5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4．請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本  OD值

2

大于標準品孔*孔的 OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計

算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

10.如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，

在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的  OD

值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋

倍數(shù)；或用標準物的濃度與 OD值計算出標

準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD值

代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋

倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

（此圖僅供參考）

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R值為  0.95以上。

2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于 9%和  11%

檢測范圍：

3 pg/mL -120 pg/mL

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個月

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